Fluorestsentsi anisotroopia

Fluorestsentsi anisotroopia on füüsikaline nähtus, kus intensiivsus on valgust kiirgava molekulil polarisatsiooni telgede suhtes ebavõrdne.

Anisotroopia kasutus

Fluorestsentsi anisotroopia mõõtmist kasutatakse peamiselt biokeemias, sest biomolekulide pöörlemise difusioon on võrreldav paljude fluorofooride lagunemise ajaga. Fluorestsentsi anisotroopiaga saab kindlaks määrata valkude suurust, kuju või hoopiski erinevate molekulide jäikust mingis keskkonnas. Lisaks veel on võimalik kasutada valk-valk-ühenduste ja membraanide kuju muutumise määramisel ning paljude ainete immuunkatsetes. Samuti on võimalik määrata näiteks valkude denaturatsiooni, sest sel juhul suureneb molekuli liikumisvõimalus. Suurenenud liikumine võib omakorda põhjustada uusi molekulidevahelisi interaktsioone, mis muudab molekuli liikumist lahuses. Tegurid, mis muudavad pöörlemise kiirust, muudavad ka anisotroopia väärtust. Anisotroopia väheneks, kui pöörlemisest tulenevat hajumist ning sisemolekulaarset võnkumist saaks vähendada.

Anisotroopia mõõtmisel valitakse molekulide hulgast valguskiirega polariseerunud ning seetõttu orienteeritud fluorofoorid. Fluorofoor neelab eelistatult valgust, mis on paralleelne selle dipoolmomendiga. Isotroopilises keskkonnas on fluorofoorid asetunud täiesti juhuslikult. Polariseeritud valgusega ergastumise momendist alates ergastab polariseeritud valgus neid fluorofoore, mille neeldumisülemineku dipool on paralleelne ergastava valguse elektrilise vektoriga. Selektiivsel ergastamisel tekivad osaliselt orienteeritud fluorofoorid ning esineb vähesel määral polariseerunud fluorestsentsi eraldumine.

Pöörlemisest põhjustatud difusioon muudab ülemineku dipoolmomenti ja see on üks peamisi molekuli depolarisatsiooni põhjuseid. Mõõtmistel on näha molekuli nurga muutust ruumis, mis toimub valguse neeldumisega ning valguse kiirgumisega. Molekuli nurga muutus sõltub sellest, kui kiiresti pöörlemine toimub ning kui kaua emiteeritakse valgust. Valguse kiirgamisaeg sõltub lahuse tihedusest, molekuli kujust ning suurusest. Väiksema viskoossuse korral liiguvad molekulid lahuses kiiremini ja sellepärast annavad kiiremini valgust ära. Väikeste fluorofooride ja väiksema lahuse tiheduse korral pöörlemisest põhjustaud difusioon on kiirem kui emissioon, mis on sellises olukorras depolariseerunud ning anisotroopia on seetõttu nullilähedane.

Mõõtmine

Fluorestsentsi anisotroopia mõõtmine

Enamikus katsetes ergastatakse proovi vertikaalselt polariseeritud valgusega. Ergastava valguse suund on orienteeritud paralleelselt vertikaalse teljega, näiteks z-teljega. Emissiooni intensiivsust mõõdetakse polarisaatoriga. Kui polarisaator on paralleelne valgusallikast tuleva intensiivsusega, siis seda tähistatakse $I\parallel$ ning kui vertikaalse intensiivsusega, on see tähisega $I\perp$. Nende suuruste põhjal saame anisotroopia väärtuse arvutamiseks valemi.

               $r=\frac{I\parallel -I\perp }{I\parallel +2I\perp }$ valem 1.1

Anisotroopia on dimensioonita suurus, sest see ei sõltu proovi summaarsest intensiivsusest, kuna paralleelse ja risti oleva intensiivsuse vahe on normaliseeritud täieliku intensiivsusega $I\sum$. Artefaktide puudumisel on anisotroopia sõltumatu fluorofoori kontsentratsioonist.

               $P=\frac{I\parallel -I\perp }{I\parallel +I\perp }$ valem 1.2

Järgnevate valemite abil saab anisotroopia ja polarisatsiooni väärtusi tuletada, kui üks suurus on teada.

               $P=\frac{3r}{2+r}$  valem 1.3

               $r=\frac{2P}{3-P}$  valem 1.4

Polarisatsioon ja anisotroopia sõltuvad mõlemad paralleelsest ja verikaalsest intensiivsusest. Anisotroopia mõiste kasutamine on eelistatud, sest see on normaliseeritud kogu intensiivsusega $I\sum$. Kui eeldada, et polariseeritud valgus läbib polarisaatori, siis $I\perp =1$ ja $P=r=1,0$. Täielikult polariseeritud emiteerunud valgust pole aga võimalik tuvastada orienteerimata molekulide puhul, kuid täielikult polariseerunud proovide puhul on. Eeldusel, et proovist tulenev kiirgus levib täiesti kaootiliselt, siis sel juhul $I\parallel =I\perp$ ja $P=r=0$. $P$ ja $r$ ei ole võrdsed, sest polarisatsioon ja anisotroopia ei ole samad nähtused.

Oletame, et polariseeritud valgus levib x-telje suhtes, siis intensiivsusi Iz ja Iy saab mõõta detektoriga, kui polarisaator asub x-teljel. Osaliselt polariseeritud valgus on defineeritud osana valgusest, mis on lineaarselt polariseeritud. Valem

$\frac{p}{p+n}$ , kus p on polariseeritud osa intensiivsus ehk $I_z-I_y$ ja n on võrdlusosa intensiivsus, mis on võrdne $2I_y$. Vertikaalselt polariseeritud ergastuse korral $I_z=I\parallel$ ja $I_y=I\perp$, see on polarisatsiooni standarddefinitsioon. Valgusallika anisotroopiat mõistetakse kui

             $r=\frac{I_z-I_y}{I_x+I_y+I_z}$  valem 1.5

Kui ergastus toimub z-telje suhtes, siis emissioon on sümmeetriline selle teljega. $I_x=I_y$, $I_y=I\perp$ ja $I_z=I\parallel$. Kui räägitakse polarisatsioonist, siis mõistetakse seda, kui valgusallika kiirguse levimist mingisuguse kindla telje suhtes. Kui fluorofoori neelatud kiirgus on orienteeritud z-telje suhtes, siis üleliigne intensiivsus, mis on paralleelne z-teljega ja on jagatud kogu intensiivsusega, on anisotroopia. Fluorofoor, näiteks dipool, ei kiirga valgust selle telje suhtes, mille järgi see on asetunud.

Iga fluorofoori jaoks on summaarne intensiivsus võrdne kolme telje intensiivsuste summaga.

$I\sum =I_x+I_y+I_z$

Iga telje intensiivsus on momendi projektsiooni ruudut. Kui kolm intensiivsust on mõõdetud, siis kõik fluorofoorid, olenemata suunast, mõjutavad summaarset intensiivsust. Olukorras, kus uuritav proov on sümmeetriline z-telje suhtes, siis $I_z=I\parallel +2I\sum$

Üksikmolekuli anisotroopia

Anisotroopiat saab vaadelda ka üksiku molekuli suhtes, kui neeldumise ja kiirgumise üleminekumoment on paralleelne. Üksikmolekuli anisotroopia on vaadeldav, kui molekul on asetunud z-teljega nurga θ alla ja y-teljega nurga ϕ alla. Isotroopses lahuses on need molekulid aga suvaliselt paigutunud. Kui ergastumine toimub z-teljel, siis asetub molekul selle telje suhtes mingisse kindlasse asendisse. Kiirguvad fluorofoorid käituvad tavaliselt nagu dipoolidki, välja arvatud, kui fluorofoorid on kiiritatud kvanditud energiaga. Anisotroopia mõõtmisel on tähtis, et me saaksime seda vaadelda ilma pöörlemisest põhjustatud difusioonita, sest siis saab seda mõõta üksikmolekuli jaoks. Ehk selleks, et molekuli anisotroopiat oleks lihtsam mõõta, ei tohiks esineda neil lahuses suurt liikumist, vaid need peaksid olema ruumis suvaliselt paigutatud ning asetuma z-teljega sümmeetriliselt. $I\parallel$ ja $I\perp$ on vastavuses dipoolmomendiga telgede suhtes. See tuleneb sellest, et dipoolmomendi ja fluorofoori põhjustatud elektrivälja projektsioonid on samad. Valemi 1.3 põhjal võib oletada, et valguse eraldumine dipoolist on sümmeetriline z-teljega.

Elektriväli

Valem 1.6 näitab fluorofoori tekitatud elektrivälja, kus $k$ on konstant, $r$ on kaugus fluorofoorist ning $\hat{\theta }$ on ühikvektor $\theta$ suhtes. Üksiku molekuli jaoks avaldub elektriväli

           $E(\theta ,\varphi )=k\frac{\sin \theta }{r}\hat{\theta }$  valem 1.6
           
           $I(\theta ,\varphi )=k^2\frac{{\sin }^2\theta }{r^2}\hat{r}$  valem 1.7

Valem 1.7 väljendab ühest molekulist eraldunud valguse intentsiivsust, mis on elektriväljaruut, kus $\hat{r}$ on levimise suuna ühikvektor. Nende valemite abil saame arvutada $I\parallel$ ja $I\perp$ mõne suvaliselt asetunud dipoolile. Elektriväli on kogu aeg ruumis asetunud tangentsiaalselt ning kesktelje suhtes on emissiooni üleminekumoment samas suunas elektriväljaga. See on sümmeetriline z-telje suhtes ning võrdub $\cos \theta$ ja intensiivsus võrdub $co{s}^2\theta$ ning kui elektriväli on sümmeetriline x-telje suhtes, siis see võrdub $\sin \theta \cos \varphi$. Tavaliselt on polariseeritud intensiivsused põhjustatud elektriväljast, et lihtsam oleks, vaadeldakse seda kui molekuli asetust mingis keskkonnas.

Suvaliselt asetunud polariseeritud fluorofoori anisotroopia on arvutatav intensiivsuste keskmise kaudu. Kui fluorofoori ergastada z-telje suhtes ning molekuli nurk on y-teljel $\varphi$, siis kõik need molekulid on ergastatud võrdsel määral. $\varphi$ väärtus võib olla 0-st kuni 2π-ni ning keskmine $si{n}^2\varphi =\frac{1}{2}$. Suvaliselt asetunud molekuli intensiivsusi saab arvutada valemi 1.8 ja 1.9 abil.

               $I\parallel (\theta )={\sin }^2\theta$ valem 1.8

               $I\perp (\theta )=\frac{1}{2}{\sin }^2\theta$  valem 1.9

Anisotroopia väärtus on alati väiksem kui 1,0. Kui molekul on asetunud paralleelselt valguse vektoriga, on fluorofooridel suurem võimalus ergastuda.

Spekter

Eeldame, et absorptsioon ja emissioon on kolineaarsed ning $r_0=0,4$, kuid paljudel fluorofooridel jääb see alla 0,4 ning sõltub ergastava valguse lainepikkusest. Kui muuta nurka $\theta$, siis anisotroopi väärtus väheneb $3{\cos }^2\theta$ võrra. Kui muuta neeldunud ja emiteerunud valguse dipooli asendit nurga $\beta$ võrra, väheneb anisotroopia. Jälgitav anisotroopia on tegelikult anisotroopia vähenemine fotoselektsiooni tõttu, sest dipoolid on ruumis asetunud kaootiliselt. Fluorofooride põhianisotroopia on väljendatud valemiga 1.10,

      $r_0=\frac{2}{5}\left(\frac{3{\cos }^2\beta -1}{2}\right)$ valem 1.10

kus $\beta$ on nurk absorptsiooni ja emissiooni üleminekul, mis osadel molekulidel on null. Kui $r_0=0,4$, siis $\beta$ on võrdne nulliga ning kui $\beta =54,7$ siis $r_0=0$. Fundamentaalse anisotroopia mõõtmiseks on vaja madalat temperatuuri, sest siis on molekulide liikumine väike. Sobivateks lahusteks on propüleenglükool ja glütserool. Anisotroopia spekter on telgedes anisotroopia ja lainepikkus. Anisotroopia ei sõltu emissiooni lainepikkusest, näiteks kui molekuli ergastada pikema lainepikkusega, siis anisotroopia väärtus kasvab.