Afiinsuskonstant

Afiinsuskonstant kui tasakaalukonstandi erijuht iseloomustab makromolekulide selektiivsust erinevate külalismolekulide suhtes tasakaaluolekus. Afiinsuskonstandi asemel võib kasutada ka terminit stabiilsuskonstant, mis iseloomustab kompleksi püsivust. Supramolekulaarkeemias nimetatakse afiinsuseks molekuli võimet moodustada võõrustaja-külalise kompleksi.

Ülevaade

Afiinsuskonstant on võtmetähtsusega faktor iseloomustamaks võõrustajamolekuli (retseptori) äratundmisvõimet kindla külalismolekuli (ligandi) suhtes. Kuna retseptori eesmärk on üldjuhul moodustada kompleksi vaid kindlate molekulidega, siis on eelistatud afiinsuskonstandi kõrgem väärtus. Praktilisest aspektist võib see olla takistuseks, kuna kõrge afiinsuse korral on pöördreaktsioon tagasi tõrjutud. Näiteks võib nimetatud probleem osutuda oluliseks keemiliste sensorite loomisel, mis on üheks retseptormolekulide rakendusalaks. Otsustades, millist võõrustajamolekuli rakenduslikel eesmärkidel kasutama hakata, võib afiinsuskonstant olla määrava tähtsusega. Seejuures on tähtsad ka molekuli teised omadused nagu lahustuvus, keemiline püsivus, kättesaadavus ja hind.

Tähtis on märkida, et afiinsuskonstandid ei sõltu ainult võõrustajamolekuli omadustest. Väga suurt rolli omavad solvendiefektid. Analüüsitavad molekulid on solvateeritud. Kompleksi tekkimiseks peab võõrustaja-külalise interaktsioon olema piisavalt tugev, et kompenseerida solvatatsiooni kadumist. Üldistatuna võib öelda, et mida poolarsemat lahustit analüüsis kasutatakse, seda madalam on afiinsuskonstandi väärtus.

Võrrand

Afiinsuskonstante leitakse järgmiste võrrandite kaudu:

$H+G\stackrel{K_{Af}}{\rightleftarrows }HG$ (1)

$K_{Af}=\frac{a_{HG}}{a_H{a}_G}$ (2)

Kus:

• H on võõrustajamolekul
• G on külalismolekul
• HG on võõrustaja-külalise kompleks
• K_Af on afiinsuskonstant
• a on aktiivsus

Üldjuhul mõõdetakse afiinsuskonstante otse võrrandi (2) suhtes. Võrrand eeldab, et tegemist on 1:1 stöhhiomeetrilise reaktsiooniga. Seega on analüüsile eelnevalt tähtis teada, mis vahekorras komplekseerumine toimub. Tulemust võidakse esitada logaritmitud kujul. Eristatakse kaht erinevat afiinsuskonstanti – absoluutset ja suhtelist. Absoluutne afiinsuskonstant K iseloomustab konkreetse võõrustajamolekuli võimet moodustada kompleksi külalismolekuliga. Seevastu suhteline afiinsuskonstant ΔK iseloomustab kahe retseptormolekuli omavahelist konkurentsi kindla substraadi suhtes. Sellega näidatakse, kui palju on üks retseptor teisest tinglikult parem.

Mõõtmised

Afiinsuskonstantide määramiseks tuleb läbi viia kvantitatiivne analüüs. Kõik afiinsuskonstantide määramise analüüsimeetodid põhinevad tiitrimisel. Võrrandite (1) ja (2) lahendamiseks on vaja teada, kui ulatuslikult tekib võõrustaja-külalise kompleks. Tasakaalulise reaktsiooni uurimiseks kasutatakse sageli UV/Vis-spektroskoopiat (UV-Vis), tuumamagnetresonantsspektroskoopiat (TMR), fluorestsentsspektroskoopiat, Raman-spektroskoopiat ja isotermilist kalorimeetrilist tiitrimist (IKT).

UV-Vis spektroskoopiline meetod

UV-Vis meetodi puhul jälgitakse tiitrimise käigus toimuvat neelduvuse muutust lahuses. Esmalt registreeritakse komplekseerumata võõrustajamolekuli neeldumisspekter. Tiitrimise käigus hakkavad spektri neeldumismaksimumid muutuma, kuni tiitrimise lõpp-punktini, kus neeldumismaksimumide muutuste ulatused vähenevad. Võrrandi (3) abil leitakse komplekseerumise ulatus, mida kasutatakse võrrandi (5) lahendamiseks.

$\alpha =\frac{[H]}{[H]+[HG]}=\frac{A-A_{HG}}{A_H-A_{HG}}$ (3)

Kus:

• α on komplekseerumise ulatus
• [H] on võõrustajamolekuli kontsentratsioon
• [HG] on võõrusta-külalise kompleksi kontsentratsioon
• A on neelduvus tiitrimispunktis
• A_G on võõrustajamolekuli neelduvus
• A_HG on võõrustaja-külalise kompleksi neelduvus

Kehtib eeldus, et vähemalt üks uuritavatest molekulidest sisaldab kromofoori. Seetõttu võib meetod olla piiratud rakendatavusega. Kehtib ka eeldus, et uuritakse ainult ühte retseptorit. Samaaegselt mitme retseptori uurimine võib tuua kaasa olukorra, kus analüüsitavad spektrid kattuvad üksteisega. UV-Vis meetodi puhul on tegemist küllaltki lihtsa, täpse ja robustse analüüsiga. Ühtlasi on UV-Vis aparatuur odavam ja kättesaadavam kui TMR aparatuur. Sarnasel põhimõttel toimub afiinsuskonstantide määramine ka fluorestsentsspektroskoopiliselt ja Raman-spektroskoopiaga.

Tuumamagnetresonantsspektroskoopiline (TMR) meetod

TMR analüüsi alguses määratakse spektris seostumisasukoha keemiline nihe. Tiitrimise käigus hakkab seostumisasukoha keemiline nihe muutuma. Lahuse küllastudes hakkab keemilise nihke muutuse ulatus vähenema, viidates tiitrimise lõpp-punkti saabumisele. Saadud informatsiooni kasutatakse võrrandite (4) ja (5) lahendamiseks, mis annab infot relatiivse afiinsuskonstandi kohta. Tulemused keskmistatakse.

TMR analüüsi käigus muutub tiitrimise tulemusena võõrustaja-külalise kompleksi seostumisasukoht. Graafikul kulgeb tiitrimine suunal alt üles

$\alpha =\frac{\delta -{\delta }_H}{{\delta }_{HG}-{\delta }_H}$ (4)

$\mathrm{\Delta }{K}_{Af}=\frac{{\alpha }_1(1-{\alpha }_2)}{(1-{\alpha }_1){\alpha }_2}$ (5)

Kus:

• α on komplekseerumise ulatus
• δ on keemilise nihke hetkeväärtus
• δ_H on retseptormolekuli seostumisasukoha keemiline nihe komplekseerumata vormis
• δ_HG on retseptormolekuli seostumisasukoha keemiline nihe tiitrimise lõpp-punktis
• ΔK_Af on suhteline afiinsuskonstant

Relatiivse afiinsuskonstandi määramise puhul on võimalik saavutada täpsemaid tulemusi võrreldes absoluutse afiinsuskonstandi määramisega.

Absoluutse afiinsuskonstandi määramiseks tuleb tiitrimise käigus täpselt fikseerida lisatud titrandi kogus. Afiinsuskonstandi väärtust saab arvutada regressioonanalüüsiga või lahendades võrrandi (6).

$K_{Af}=\frac{(1-\alpha ){\gamma }_{HG}}{\alpha [G]{\gamma }_G}$ (6)

Kus:

• K_Af on absoluutne afiinsuskonstant
• ƴ_HG on võõrustaja-külalise kompleksi aktiivsuskoefitsient
• ƴ_G on külalismolekuli aktiivsuskoefitsient
• [G] on külalismolekuli kontsentratsioon

TMR analüüs pakub mitmeid eeliseid võrreldes teiste meetoditega. Nendest üks praktilisemaid on võimalus analüüsida samaaegselt mitut erinevat retseptorit, kuid seda siiski vaid ühe substraadi suhtes. Erinevate retseptorite seostumisasukohad ei tohi spektris kattuda. Analüüsides peab kasutama alati sama solventi. TMR meetodid võimaldavad määrata ka täpse seostumisasukoha. Seda teadmist saab arvesse võtta uute võõrustajamolekulide disainimisel. Võrreldes UV-Vis ja fluorestsentsmeetoditega on TMR analüüs vähem tundlik, mistõttu on mõõtmisteks vaja kasutada mõnevõrra suuremaid ainekoguseid. Möödapääsmatu on deuteeritud solvendi kasutamine. Mõõtes absoluutseid afiinsuskonstante, võib raskendatud olla väga suurt afiinsuskonstandi väärtust omavate molekulide uurimine. Relatiivsete afiinsuskonstantide määramisel on võimalik sellest probleemist hoiduda. Metoodikate kitsaskohtadest mööda vaadates võib suurimaks takistuseks olla hoopis TMR aparatuuri kättesaadavus. Seade on kallis ja selle käsitsemine nõuab rohkem teadmisi kui teised meetodid.

Isotermiline kalorimeetriline tiitrimine

Isotermilise kalorimeetrilise tiitrimise (IKT) puhul mõõdetakse uuritavas lahuses toimunud soojushulga muutust tiitrimise käigus. Adiabaatilises nõus on võõrustajamolekuli lahus, mille kohal on süstal külalismolekuli lahusega. Tiitrimise käigus toimub komplekseerumine, mille tulemusel lahus kas neelab või eraldab soojust. Soojushulk on proportsionaalne seostumise ulatusega. Sarnaselt teiste afiinsusmõõtmistega hakkab analüütiline signaal tiitrimise lõpus vähenema, kuni jääb alles ainult taustsignaal lahuse lahjendamisest. Ühe eksperimendiga on võimalik saada infot nii afiinsuskonstandi, reaktsiooni stöhhiomeetria, entalpia ja entroopia kohta. Sel juhul leitakse afiinsuskonstant võrrandi (7) lahendamisel.

$\mathrm{\Delta }G=-RTln{K}_{Af}=\mathrm{\Delta }H-T\mathrm{\Delta }S$ (7)

Kus:

• ΔG on Gibbsi energia muutus
• R on universaalne gaasikonstant
• T on temperatuur
• ΔH on entalpiamuut
• ΔS on entroopiamuut

IKT analüüsi peetakse tundlikuks ja paindlikuks mittedestruktiivseks analüüsimeetodiks. Mõõtmisteks vajalik ainehulk on väike, jäädes mikromolaarsesse suurusjärku. Võrreldes spektroskoopiliste meetoditega on analüütilise signaali registreerimine aeglasem, ent analüüs tervikuna küllaltki kiire (1–3 tundi). IKT ei sea eeldusi lahuse pH-le ega läbipaistvusele, mis on tähtsad UV-Vis analüüsi puhul. IKT aparatuur on võrreldes spektromeetritega oluliselt odavam. Selle käsitsemine ei nõua erilisi eelteadmisi. Aparatuur on täielikult automatiseeritav. IKT analüüsi rakendatakse peamiselt biomolekulide uurimiseks ja see on tihti sekundaarseks analüüsivahendiks mõne teise meetodi kõrval.