Försteri-tüüpi resonantne energiaülekanne

Jablonski diagramm FRET kohta. Tõlge inglise keelest: Donor, doonor; Acceptor, aktseptor; Absorption, neeldumine; Relaxation, soojuslik relaksatsioon; Fluorescence, fluorestsents.

Försteri tüüpi resonantne energiaülekanne (FRET) on elektronide ergastatud oleku energia mittekiirguslik üleminek ühelt fluorestseeruvalt molekulilt või molekuli osalt (fluorofoorilt) teisele, mis võib aset leida, kui on täidetud järgmised tingimused:

• Fluorofoorid asuvad ruumiliselt piisavalt lähedal, 1–10 nm suurusjärgus (tüüpiliselt 3–6 nm);
• Fluorofoorid on sobilikult orienteeritud teineteise suhtes;
• Ühe fluorofoori (nn doonori) emissioonispekter kattub teise fluorofoori (nn aktseptori) ergastusspektriga – ehk doonori ja aktseptori energeetilised tasemed on võrreldavad, luues eeldused resonantsi toimimiseks.

Erialakirjanduses tähistatakse Försteri tüüpi resonantset energiaülekannet lühendiga FRET, kus T tuleneb ingliskeelsest sõnast transfer. Sageli tõlgendatakse lühendi esimest tähte vihjena fluorestsentsile, kuid see käsitlus on eksitav, sest fluorestsents on kiirguslik protsess, seevastu FRET on mittekiirguslik.

Elektroonsed ja energeetilised üleminekud

Kaht fluorestseeruvat valku (doonor CFP ja aktseptor YFP) ja fosfodiesteraasi PDE5 fragmenti sisaldava sensori kasutamine tsüklilise guanosiinmonofosfaadi (cGMP) määramiseks rakkudes. Sensori algses olekus on FRET valkude vahel piiratud, sest valkude vahekaugus on suur. Ajahetkel t₀ lisatakse süsteemi aine, mis aktiveerib cGMP tootmist. cGMP seondumisel sensori PDE5 fragmendiga muutub sensori ruumiline struktuur, CFP ja YFP lähenevad teineteisele ning FRET efektiivsus kasvab. Tulemusena väheneb CFP fluorestsentsi intensiivsus (sest CFP energia lahkub eelistatult FRET kaudu) ning kasvab YPF fluorestsentsi intensiivsus. Tõlge saksa keelest: Fluoreszenzintensität, fluorestsentsi intensiivsus; Zeit, aeg.

FRET toimumiseks peab doonor olema ergastatud olekus ning seda saavutatakse kiirgusliku ergastamise teel (molekulis neeldub footon elektromagnetikiirguse UV-alast või nähtavast alast). Ergastatud doonor viibib enamasti singletses olekus (S₁^D) ehk molekulis jäävad kõik elektronid paardunuks. FRET tulemusena kantakse energia mitte-kiirguslikult üle aktseptorile, saavutades aktseptori ergastatud singletset olekut (S₁^A). Mõnevõrra erandlikumad on juhud, kus doonori ergastatud olek on tripletne, ehk molekulis on kaks paardumata elektroni (st tegemist on fosforestseeruva doonoriga). Sel juhul toimub FRET doonori tripletest olekust T₁^D ja viib aktseptori singletsesse olekusse S₁^A. Protsessina konkureerib FRET seega doonori fluorestsentsi või fosforestsentsiga (kuivõrd osa doonori ergastatud oleku energiast lahkub tüüpiliselt siiski valgusena) ning soojusliku relaksatsiooniga.

FRET kaudu saadud energia lahkub fluorestseeruvast aktseptorist kas valguse või soojusena. Põhimõtteliselt võib FRET toimuda ka süsteemides, kus aktseptor ei ole fluorestseeruv (st tegemist on molekuliga, mis neelab valgust, kuid ei emiteeri seda). Sellisel juhul saab FRET toimumist tuvastada, mõõtes doonori fluorestsentsi intensiivsuse või eluea muutusi (vt ka valemid allpool).

Jaanimardiklaste sugukonnale on omane bioluminestsents. Info putukate ensüümi lutsiferaasi struktuuri kohta kohta võimaldas võtta kasutusele BRET nähtusel põhinevad sensorid.

Försteri-tüüpi resonantse energiaülekandega on mõnevõrra sarnane bioluminestsentsi resonantne energiaülekanne (BRET), mille puhul doonori ergastatud olek saavutatakse mitte footoni neeldumise teel, vaid keemilise reaktsiooni tulemusena. BRET puhul kasutatakse ergastatud doonormolekuli tekitamiseks enamasti ensüümi lutsiferaasi ja selle analooge: need katalüüsivad hapniku ja sageli ka ATP osavõtul kulgevat reaktsiooni, mille tulemusena eraldub luminestseeruv produkt. See käitub doonorina, mille energiat saab fluorestseeruvale aktseptorile mitte-kiirguslikult üle kanduda.

Kvantitatiivsed karakteristikud

FRET efektiivsust E saab arvutada energiaülekande tõenäosusena doonori iga ergastuse kohta:

$E=\frac{k_{\text{ET}}}{k_f+k_{\text{ET}}+\sum k_i},$

kus k_ET tähistab energiaülekande kiirust, k_f doonori kiirgusliku relaksatsiooni kiirust ja k_i mitte-kiirguslike relaksatsiooniprotsesside kiiruseid.

Viga pisipildi loomisel:

Näide fluorestseeruvaid valke CFP ja YFP sisaldavast FRET-sensorist. Valke ühendava aminohappelise järjestuse proteolüütilisel lagundamisel suureneb vahekaugus valkude vahel ning FRET ei saa enam toimida.

FRET efektiivsus on määratud ka doonori ja aktseptori vahekaugusega r vastavalt valemile:

$E=\frac{1}{1+(r/R_0{)}^6}\text{,}$

kus R₀ tähistab nn Försteri raadiust ehk vahekaugust, mille puhul FRET efektiivsus on 50%. Försteri raadius on erinev iga doonor-aktseptor-paari jaoks. Näiteks laialdaselt kasutusel olev FRET-paar, mis koosneb helesinisest fluorestseeruvast valgust (CFP, doonor) ja kollasest fluorestseeruvast valgust (YFP, aktseptor) omab R₀ väärtust ligi 4.9 nm, samas fluorestseeruvatest valkudest LSSmOrange (doonor) ja mKate2 (aktseptor) koosnev FRET-paar omab R₀ väärtust ligi 7.0 nm. Försteri raadius oleneb omakorda sellest, kui tugev on spektraalne kattuvus J doonori emissioonispektri ja aktseptori ergastusspektri vahel:

${R_0}^6=\frac{2.07}{128{\pi }^5{N}_A}\frac{{\kappa }^2{Q}_D}{n^4}J,$

kus κ võtab arvesse doonori ja aktseptori dipoolide vahelist nurka, Q_D on doonori kvantsaagis, N_A on Avogadro arv ja n on keskkonna murdumisnäitaja.

Praktilisem viis FRET efektiivsuse arvutamiseks võtab arvesse doonori fluorestsentsi intensiivsust aktseptori juuresolekul (F_D’) või puudumisel (F_D):

$E=1-\frac{{F_{\text{D}}}^{\prime }}{F_{\text{D}}}$

Analoogselt võib kasutada ka doonori fluorestsentsi eluiga aktseptori juuresolekul (τ_D’) või puudumisel (τ_D), kuivõrd aktseptori olemasolu suunab doonorist kui süsteemist energia välja (FRET kaudu) ning seega väheneb doonori molekulide populatsioon, mis võib valgust emiteerida:

$E=1-\frac{\tau {\text{'}}_{\text{D}}}{{\tau }_{\text{D}}}$

Fluorestsentsi eluea mõõtmisel põhinevad lähenemised ei sõltu seejuures oluliselt doonori ega aktseptori kontsentratsioonist, kuni doonori signaal on tuvastatav ja aktseptorit on piisavalt, et doonori signaali mõjutada.

Ajalugu ja rakendused tänapäeval

FRET aluspõhimõtteid sõnastas esimesena saksa teadlane Theodor Förster 1946. aastal. Tänapäeval kasutatakse FRET nähtust laialdaselt bioloogiliste molekulide uuringutes, mõõtes energiaülekande efektiivsust ning hinnates selle alusel fluorofooridega ühendatud valkude vastastikmõju tugevust või konformatsioonilisi muutusi.

Näide FRET-sensorist, mida kasutatakse cAMP sisalduse määramiseks rakkudes. Selle sensori puhul väheneb analüüdi juuresolekul FRET efektiivsus doonori ja aktseptori vahel.

Näiteks on olemas mitmeid geneetiliselt kodeeritud FRET-sensoreid. Neid viiakse rakkudesse DNA kujul ning DNA transkribeerimisel ja transleerimisel saab rakk toota ühte või mitut valgulist konstrukti, mis sisaldavad fluorestseeruvaid valke ja lisaelemente, mis tagavad sensori funktsionaalsust. Sel viisil on disainitud muuhulgas sensorid sekundaarse virgatsaine cAMP mõõtmiseks: sensori koosseisu kuulub valgul Epac põhinev „kassett“ cAMP sidumiseks, mis on ühendatud fluorestseeruvate valkudega CFP ja YFP või nende analoogidega. cAMP puudumisel saab toimuda FRET CFP (doonor) ja YFP (aktseptor) vahel, kuid cAMP seostumisel Epac külge muutub sensori ruumiline struktuur ning FRET efektiivsus väheneb.

Fail:FRET probe for the detection of Cd2+.gif

Sünteetilistest orgaanilistest fluorofooridest koosnev sond kaadmiumiooni määramiseks. Analüüdi juuresolekul FRET efektiivsus kasvab, kuna doonor ja aktseptor paigutuvalt sobivalt teineteise suhtes.

Sarnasel põhimõttel töötavad geneetiliselt kodeeritud FRET-sensorid rakusurma läbiviivate ensüümide kaspaaside aktiivsuse hindamiseks. Kaspaaside sensorites on kesksel kohal aminohappeline järjestus, mida kaspaas peab oma substraadiks; see järjestus on ühendatud fluorestseeruvate valkudega GFP ja RFP või nende analoogidega. Kaspaasi puudumisel saab toimuda FRET GFP (doonor) ja RFP (aktseptor) vahel, kuid kaspaasi juuresolekul toimub ühendava aminohappelise järjestuse lagundamine, kuna kaspaas on olemuselt proteaas. Ühendava ahela lagundamise tulemusena lahknevad fluorestseeruvad valgud teineteisest ning FRET efektiivsus väheneb.

Samas eksisteerib ka mitmeid FRET-sensoreid, mille koostisse kuuluvad sünteetilised orgaanilised fluorofoorid või hoopis anorgaanilised nanoosakesed (nt kvanttäpid).

Struktuurselt jäikade ning korduvatest elementidest koosnevate DNA või oligoproliini järjestuste ühendamisel väikese molekulmassiga fluorofooridega on võimalik saada nn molekulaarseid joonlaudu. Tänu sellele, et FRET efektiivsus sõltuvu sõltub oluliselt doonori ja aktseptori vahekaugusest, võimaldavad sellised joonlauad mõõta vahemaid keerulistes bioloogilistes süsteemides.

Rahvusvahelise teaduskirjanduse andmebaasi PubMed statistika kohaselt on igal aastal ajavahemikus 2013–2023 ilmunud ligi 1000 artiklit, mis kasutavad märksõnana FRET.